Cryoconservation de la semence canine - Mise au point d'un nouveau diluant à base de plasma de jaune d’oeuf lyophilisé

Abstract

La présente étude se divise en deux parties :La première partie vise à optimiser le protocole de lyophilisation du PJO (pour obtenir une meilleure redispersibilité des particules après reconstitution) en étudiant quatre facteurs à savoir la vitesse de congélation du PJO avant lyophilisation (rapide/lente), le milieu de reconstitution (Tris-Fructose/NaCl 0.9%/PBS), la durée de dessiccation primaire (12H/24H/36H) et secondaire (0H/8H/16H). Le PJO est fractionné au niveau de la PBRC/Univ Blida1 selon le protocole conventionnel de MacBee et Cotterill (1979) puis transporté sous +4°C jusqu’au CRAPC de Bousmaïl où plusieurs cycles de lyophilisation sont réalisés (répliqué 3x) au moyen d’un lyophilisateur de laboratoire (Lyophilisateur ALPHA 2-4 LSC Plus, MARTIN CHRIST) en comparant les différentes modalités de variation des quatre facteurs étudiés. Le protocole de lyophilisation le plus adapté au PJO semble être d’une durée globale de 2H, avec une congélation rapide, et d’une dessiccation primaire de 24H (Vide : 100mTorr, -20°C) et d’une dessiccation secondaire de 16H (Vide : 100mTorr, +20°C). Ce protocole optimisé est retenu pour les expériences de la deuxième partie.La deuxième partie vise à évaluer la fertilité in-vitro et in-vivo de la semence canine congelée dans trois dilueurs à base de 6% LDL (Dilueur de référence) et 40% de PJO liquide et lyophilisé (Concentrations optimales rapportées dans les études précédentes). Pour cela, 60 éjaculats sont récoltés à partir de 20 chiens à raison de 3 récoltes par chien à 3 jours d’intervalle minimum. Après une évaluation initiale de la congélabiblité, la semence est diluée dans les trois dilueurs étudiés (n=20 / diluer), équilibrée à +4°C pendant 1h30 puis conditionnée dans des paillettes fines Cassou (0.25mL) et congelés dans un congélateur programmable (Mini-Digit-Cool, IMV-Technologies, Aigles, France) puis immergées dans de l’azote liquide et conservées dedans jusqu’à utilisation. Les Paillettes sont décongelées à 37°C pendant 30secondes dans un décongélateur de paillasse (IMV-Technologies, Aigles, France) puis utilisées soit pour une analyse de fertilité in vitro par Analyseur d’image (HT-IVOS II) et cytomètre en flux (EasyCyte Plus II), soit pour une insémination artificielle. Les cycles oestraux des femelles sont suivis par cytologie vaginale combinée au dosage de la P4 pour déterminer le moment optimum de fécondabilité. Deux inséminations à 24H d’intervalle sont effectuées en déposant 200-300 millions de spermatozoïdes (8-12 paillettes) dans l’utérus par voix transcervicale au moyen d’un vidéo-endoscope (Télépack Vet, Storz). La gestation est confirmée après au moins 15 jours par échographie (MyLab Class C, ESAOTE) puis suivie jusqu’à mise-bas.