Production purification et caractérisation biochimique et moléculaire d'une nouvelle protéase nomée SAPHM de la souche K7A de bacillus licheniformis, isolée de la région de Hassi Messaoud, sud est d'Ourgla en Algérie

Abstract

Le présent travail s’inscrit dans le cadre de la recherche de nouvelles activités protéasiques, plus efficaces et d’intérêt industriel. Au cours d’un criblage de nouvelles souches productrices de protéases agissant dans des conditions extrêmes, une souche bactérienne a été isolée à partir d’un échantillon du sol de la région de Hassi Messaoud (Ouargla, Algérie). La souche K7A a été identifiée comme Bacillus licheniformis, et a fait l’objet de ce travail. Au cours de ce travail nous nous sommes intéressés dans un premier temps à l’élaboration d’un milieu simple pour la production de protéases alcalines par la souche K7A de Bacillus licheniformis. La production, à l’échelle Erlenmeyer, est optimale de 12500 U/mL à 45 °C après 24 h de culture. Les techniques de purification utilisées dans ce travail, ont permis d’aboutir à une solution enzymatique homogène ayant une masse moléculaire de 30 kDa déterminée par SDS-PAGE. Sa pureté a été également vérifiée par le séquençage de son extrémité NH2-terminale (26 aa), qui montre une forte homologie avec les protéases à sérine de Bacillus avec une identité de 97 %. L’optimum de l’activité protéase est obtenu à pH 10 et à 70 °C sur caséine. Cette enzyme demeure pratiquement stable aux pH basiques (7-12) pendant 24 h. Il s’agit d’une enzyme appartenant à la famille des protéases à sérine de fait qu’elle est inhibée par les inhibiteurs spécifiques des enzymes à sérine (PMSF et DFP). Sa thermoactivité et sa thermostabilité sont considérablement améliorées par le calcium à 2 mM et le sorbitol à 10 %. La SAPHM se distingue par une large spécificité vis-à-vis des substrats protéiques et elle douée d’une meilleure efficacité catalytique en comparaison avec la protéase Alcalase Ultra 2,5 L. L’enzyme SAPHM présente également une stabilité remarquable en présence des différents tensioactifs (SDS, Tween 20, Tween 80, Triton X-100 et CTAB) et des agents de blanchiments (Perborate de sodium, H2O2 et Urée). D’autre part, le gène sapHM codant la nouvelle protéase SAPHM a été cloné, séquencé et exprimé chez le système Escherichia coli BL21(DE3) pLysS. La protéine recombinante (rSAPHM) s’exprimant chez E. coli BL21(DE3) pLysS dans l’espace extracellulaire, possède des caractéristiques identiques à celles trouvées pour la protéine native (SAPHM). La protéase SAPHM montre une bonne activité, stabilité et tolérance en présence de certains solvants organiques, ainsi cette protéase présente une stabilité et compatibilité remarquable avec les détergents liquides et solides (Pril-iSiS, Tide, Dipex, Nadhif, Dixan et Skip) par rapport à l’enzyme commerciale Alcalase Ultra 2,5 L. Egalement l’ajout de la protéase SAPHM à la solution détergente améliore les performances du détergent Pril-iSiS dans le sens d’une meilleure décoloration des taches du sang.